求瑞氏染色的原理~

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求瑞氏染色的原理~
参考答案
瑞氏( Wright ' s staim ;美蓝-伊红Y)染色:
1 .瑞氏染料是由碱性染料美蓝( Methvlem blue )和酸性染料黄色伊红( Eostm Y )合称伊红美蓝 染料即瑞氏 (美蓝-伊红Y)染料.
伊红钠盐的有色部分为阴离子,无色部分为阳离子,其有色部分为酸性,故称伊红为酸性染料.美蓝通常为氯盐是碱性的,美蓝的中间产物结晶为三氯化镁复盐,其有色部分为阳离子,无色部分为阴离子,恰与伊红钠盐相反.
2 .用 甲醇作瑞氏 染料溶剂,即成瑞氏染液.甲醇是瑞氏染料良好溶剂,有两种作用:
( 1 )甲醇使瑞氏染料中美蓝( M )与伊红( E )在溶液中离解,可使细胞成分选择性吸附其中的有色物质而着色.
甲 醇
ME (瑞氏染料)—— —— → M + + E -
在配制的瑞氏染液中美蓝如放置过久即可氧化而含有天青,美蓝天青与伊红化合物能使核染成紫红色,但不能使胞浆染为蓝色,多余 美蓝就可以 使胞浆染成蓝色,染色主要是化学作用,是离子彼此结合的反应.
( 2 )甲醇具有强大的脱水力,可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积,提高细胞对染料吸收作用,同时由于甲醇吸附染色液中的水,使染色液升温,加速染色反应.
3.瑞氏染液配制:
(1) 瑞氏染液配制:
瑞氏染料 830gm 或 1g
甲醇( AR ) 500ml 或 600ml
先称干燥(事先放入温箱干燥过夜)瑞氏染料放置乳钵内,用乳棒轻轻 敲碎染料成粉末,再行研磨至听不到 研芝麻声 即呈细粉末,加少许甘油或甲醇溶解研磨,使染料在乳缸内显“一面镜”光泽,而无染料粉粒沉着,再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮,静置片刻,将上层液体倒入 一 清洁储存瓶内(最好用甲醇空瓶),再加甲醇研磨,重复数次,直至乳钵内染料及甲醇用完为止,摇匀,密封瓶口,存室温暗处,储存愈久,则染料溶解、分解就越好,一般储存 3 个月以上为佳.
(2) 缓冲液:
1) 缓冲液作用:染色对氢离子浓度是十分敏感的,据观察 pH 值的改变,可使蛋白质与染料形成的化合物重新离解.缓冲液须保持 一定的 pH 使染色稳定,PBS 的 pH 一般在 6.6.8 ,偏碱性染料可与缓冲液中 酸基起 中和作用,偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用,使 pH 恒定.
2) 缓冲液配制( pH6.6.8 ,弱酸性):
配方 1 :配方 2 :
1% KH 2 PO 4 30ml M/15 KH 2 PO 4 73.5 ml
1% Na 2 HPO 4 20ml M/15 Na 2 HPO 4 26.5ml
H 2 O( 新鲜 ) 加至 1000ml
置室温黑暗处,瓶口密封,防止霉菌污染,如有污染则应报废.
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